编者按：
活菌数是益生菌产物的主要属性之一，因为活菌数可能会影响益生菌产物的结果。活菌数不仅对于益生菌企业和消费者具有主要的意义，对于监管部分而言也十分主要。那么活菌数要怎么检测呢？除了平板培育以外，还有什么其他方式吗？
今天，我们配合存眷活菌数的检测，但愿本文可以或许为相关的财产人士和诸位读者带来一些开导和帮忙。
① 活菌检测
今朝，益生菌行业公认的益生菌界说，是 2001 年结合国粮食及农业组织/宿世界卫生组织结合工作组提出的：益生菌是指当摄入足够数目时，会对宿本家儿发生健康益处的活性微生物[1]。是以，按照界说，“活性”是益生菌的一个主要特征。
此外，我国 2005 年发布的《益生菌类保健食物申报与审评划定（试行）》中第十二条也明白划定了[2]，活菌类益生菌保健食物在其保质期内活菌数量不得少于10[6] CFU/mL(g)。
是以，精确测定益生菌产物中的活菌数目，对出产商和消费者，以及监管部分来说，都意义重大。
今朝，我国益生菌行业本家儿要依据《食物平安国度尺度-食物微生物学查验-乳酸菌查验 GB4789.35—2016》对活菌数进行检测。该尺度采用了培育法来检测食物中的活菌数。
不外跟着手艺的不竭成长，当前呈现了一些检测活菌数目的新方式，此中一些方式具有必然的应用前景，有机遇在将来普遍应用于益生菌产物的活菌检测。今天，我们将介绍几种用于活菌检测方式，并切磋分歧方式的好坏之处。
② 基于分手培育：平板计数
平板菌落计数法是指将样本进行恰当的持续稀释后，取必然量的稀释样液涂布到平板长进行培育，对菌落形当作单元（CFU）进行计数，获得现存活菌数目的估量值，并暗示为每克或毫升原始样本的菌落形当作单元的方式[3]。
该方式的关头在于得当的原始样品的稀释倍数——将培育后的细菌菌落节制在 30-300 个为宜。
这种活菌检测的方式，是当前应用最普遍、最经典的微生物学检测手艺之一，除了被应用于检测食物中的活菌数，它还经常被用于水质的检测[4]。该方式具有当作本低、易操作的庞大优势，但同时也有必然的局限性。
平板菌落计数法存在耗时长，难以应付发展迟缓、活的“不成培育的”微生物的错误谬误。不仅如斯，跟着益生菌相关研究的不竭深切，将来将呈现越来越多样的微生物菌种（菌株），对于这些没有培育过的菌株，试验前提都需要试探与测验考试。
除此之外，该方式测定的成果是总活菌数目，无法精确区分益生菌产物中分歧菌株细菌的活菌数量，而当前越来越多的益生菌产物采用多菌株，是以急需其他活菌检测方式来填补上述缺陷。
③ 基于基因表达活性：qPCR
转录组可以反映出微生物的活力状况，是以，当前有一些研究人员起头测验考试操纵细菌的信使 RNA（mRNA），来测定活菌数量。
定量逆转录 PCR（RT-qPCR）是一种用于检测基因转录环境的常见研究方式。在该方式中，信使 RNA（mRNA）首先经由过程逆转录酶转录当作互补 DNA（cDNA）。随后，以 cDNA 为模板进行 qPCR 反映。是以，我们可以拔取微生物特定基因的 mRNA 作为检测靶标，操纵该方式对样品中的活菌数量进行测定。
为提高基于 mRNA 检测方式的精确性，RT-qPCR 可与叠氮碘化丙锭染色（PMA，可选择性标识表记标帜死细胞）和 16S rRNA 测序等手艺联用[5]，设置死菌阳性对照组，区分出活菌。
今朝已有一些文献采用这种方式来检测产物中的活菌数目，好比普遍应用于畜禽养殖中的粪肠球菌[6]。
此种基于基因表达活性的检测方式，具有活络度高、特异性强、快速的优势；但样品制备过程中的细小转变，城市影响最终的测定成果，对尝试情况和操作人员的要求较高。同时，还需要按照分歧的微生物，拟定分歧的检测靶标和对应尺度。
图.流式细胞仪
④ 流式细胞分选手艺
跟着手艺的成长，流式细胞分选手艺已经当作为生命科学范畴的常见尝试手段之一。在染色或荧光标识表记标帜的根本上，可以利用流式细胞分选手艺对细菌进行计数。
流式细胞分选手艺是一种操纵高能量激光照射高速流动状况下被荧光色素染色的单细胞或微粒，测量其发生的散射光和发射荧光的强度，从而对细胞（或微粒）的物理、心理、生化、免疫、遗传、分子生物学性状及功能状况等进行定性或定量检测的现代细胞阐发手艺，它可按照发射光的荧光强度和波长将发光颗粒亚群分隔，并可实现单克隆分选，从而对复杂样本中的细胞进行分类、定量和分手。
流式细胞分选手艺具有切确度高，速度快，许可一次检测大量细菌，可对分歧的细菌进行分选，检测活菌分歧的心理活性和细菌大小的优势[7]。
但因为流式细胞分选手艺复杂昂贵，今朝本家儿要应用于科学研究，尚未遍及用于益生菌产物的活菌数查验，不外国外已有以此作为出厂检测尺度的先例。
⑤ 拉曼光谱检测方式
1928 年，在研究单色光穿过透明液体介质时，印度物理学家 C.V. Raman 初次发现，入射光中很少一部门光子，与介质发生了非弹性碰撞，即入射光照射在介质上时，与介质的分子或原子发生了能量互换，散射出来的光与入射光的振动频率分歧——这就是闻名的拉曼光谱效应。
在这一理论根本上，成长起来的阐发手艺被称为拉曼光谱手艺，可普遍应用于液体、气体和固体的检测，且可获得振动频率为 50-4000cm[-1 ]的分子指纹信息[8]。是以，它已被普遍用于多个范畴的化学及生物分子的判定与研究中，如食物检测、生物医药、情况卫生和石油化工等。
拉曼光谱手艺也可用于活菌计数。有研究人员曾操纵活菌与死菌概况电荷的分歧，在活菌概况吸附银离子后进行还原，测试其拉曼加强旌旗灯号，成果显示经完全灭活的细菌，几乎没有拉曼加强旌旗灯号，而活菌概况的拉曼加强旌旗灯号，则很是丰硕，以此来分辨活菌[9]。
还有研究人员将分手培育与拉曼光谱手艺相连系，以重水制备的营养肉汤培育沙门氏菌，进行氘元素标识表记标帜，并与共聚焦显微拉曼光谱联用，以氘元素特征拉曼光谱峰，监测区分沙门氏菌为死菌仍是活菌[10]。
该手艺可从分子程度上，切确反映样品的化学当作分构成和分子布局差别，而且概况加强拉曼光谱手艺、共聚焦显微拉曼光谱手艺的呈现，使得其在阐发判定过程中，加倍直不雅、易于不雅察和节制，而且成果加倍显著，这些优势极大地促进了拉曼光谱手艺的成长。
不外因为该手艺还在研究之中，所以仍有一些问题需要降服。好比该手艺难以区分分歧组分拉曼峰的叠加，易呈现某些待测物质峰被袒护，造当作某些组分信息不克不及完全揭示，从而影响最终成果的精确性。
今朝，有很多研究人员正在积极降服这些局限性，鞭策拉曼光谱手艺的应用，并认为该方式有望当作为替代培育法的新一代活菌数检测方式。
⑥ 其他方式：细菌的产品
除了拉曼光谱之外，还有一些新型的检测活菌的方式。益生菌在发展和发酵过程中，可能会排泄一些物质或放出一些气体，在这些生物标识表记标帜物的根本上，也可以经由过程检测活菌发生的排泄物或气体的量，间接确定活菌的数量。
潜在的可用于活菌检测的排泄物有：III 型排泄卵白 SpaO、卵白质前体易位酶等[11]。
此外，一些益生菌会发生短链脂肪酸等酸性物质，使样品的 pH 值降低，用溴甲酚紫、酚酞、硝基酚等作为 pH 指示剂，或操纵高精度的 pH 计，检测 pH 值的转变量，从而换算出产酸量，并推算出活菌数量[12]。
这类新型的检测方式想象空间庞大，但今朝仍然很不当作熟，而且操纵生物标识表记标帜物区分死活菌的尺度仍不周全。可是，相信在不久的未来，这些活菌检测手段会逐渐当作熟，为我们检测活菌数供给更多的可能。
参考文献：
[1] Joint FAO/WHO Working Group Report on Drafting for the Evaluation of Probiotics in Food. London, Ontario, Canada: FAO/WHO; 2002. Guidelines for the evaluation of probiotics in food.
[2] 益生菌类保健食物申报与审评划定(试行)[J]. 中国食物卫生杂志, 2005(04):369-370.
[3] Davis C . Enumeration of probiotic strains: Review of culture-dependent and alternative techniques to quantify viable bacteria - ScienceDirect[J]. Journal of Microbiological Methods, 2014, 103:9-17.
[4] Rygala A, Berlowska J, Kregiel D. Heterotrophic Plate Count for Bottled Water Safety Management. Processes. 2020; 8(6):739. https://doi.org/10.3390/pr8060739
[5] McCarty, S.C., Atlas, R.M. Effect of amplicon size on PCR detection of bacteria exposed to chlorine. PCR Methods Appl. 1993, 3, 181–185.
[6] Tan G, Zhou R, Zhang W, et al. Detection of Viable and Total Bacterial Community in the Pit Mud of Chinese Strong-Flavor Liquor Using Propidium Monoazide Combined With Quantitative PCR and 16S rRNA Gene Sequencing. Front Microbiol. 2020;11:896. Published 2020 May 26. doi:10.3389/fmicb.2020.00896
[7] Tracy, B.P., Gaida, S.M., Papoutsakis, et al. Flowcytometry for bacteria: enablingmetabolic engineering, synthetic biology and the elucidation of complex phenotypes. Curr. Opin. Biotechnol. 2010, 21, 85–99.
[8] Srivatsan T S. Practical Raman Spectroscopy: An Introduction[J]. Materials and Manufacturing Processes，2014. 29(5): 649-649.
[9] Zhou H, Yang D, Ivleva N P, et al. Label-Free in Situ Discrimination of Live and Dead Bacteria by Surface-Enhanced Raman Scattering[J]. Analytical Chemistry，2015. 87(13): 6553-6561.
[10] 冯敬敬. 拉曼光谱在食物包装和生物污染物快速检测中的应用[D]. 江南大学, 2019.
[11] Gao, R, Liao, X, Zhao, X, Liu, D, Ding, T. The diagnostic tools for viable but nonculturable pathogens in the food industry: Current status and future prospects. Compr Rev Food Sci Food Saf. 2021; 20: 2146– 2175. https://doi.org/10.1111/1541-4337.12695
[12] https://www.sas.upenn.edu/LabManuals/biol275/Table_of_Contents_files/14-Enumeration.pdf
作者｜Jessica
审校｜617
编纂｜笑咲
